Studium der Medizin und Zoologie in Jena, wo Ernst Haeckel, der sprühende Verfechter von Darwins Lehre, und der vergleichende Anatom Carl Gegenbaur entscheidende Anregungen gaben. 1872 Promotion zum Dr. med. in Jena, 1872-1874 Assistent am anatomischen Institut in Bonn bei Max Schultze, dem Schöpfer des Zellbegriffs. 1875 in Jena Promotion zum Dr. phil. und Habilitation für Zoologie. 1881 Berufung als Ordinarius nach Königsberg, 1883 nach Bonn, 1885 nach München, wo er durch 40 Jahre die Zoologische Staatssammlung und das aus ihr herausgewachsene Zoologische Institut leitete.

Dieses entwickelte sich zum einem internationalen Zentrum der Biologie, bevölkert von Studenten und Gästen aus allen Erdteilen. Mehr als 100 von Hertwigs Schülern wurden selbst Professoren. Er war ein hervorragender Lehrer und vielen blieb er ein väterlicher Freund. Sein klassisches Lehrbuch der Zoologie hielt er durch 15 Auflagen auf der Höhe.

Hertwigs Jugendarbeiten, meist gemeinsam mit seinem Bruder Oscar (später Anatom in Berlin), waren ausgezeichnete morphologische Untersuchungen alter Schule. Weitere Arbeiten über die Befruchtung und Entwicklung der Seeigeleier führten ihn bald zu kausaler Fragestellung und machten ihn zum Mitbegründer der experimentellen Biologie. Untersuchungen zu allgemeinen Problemen der Zellenlehre, der Protozoenkunde, zur Vererbung und Geschlechtsbestimmung haben auch der Medizin manches gegeben.