Früh waren seine polyglotten Interessen erwacht (deutsch, venezianisch, italienisch und slowenisch). Als 17jähriger ließ er Studien über das Friaulische erscheinen (1846). 1852 übersiedelte er nach Italien, wo er im Verlauf vieler Jahre mehrere Arbeiten zum Italienischen hervorbrachte. In einer der späteren entwickelte er die erste wissenschaftliche Klassifikation der italienischen Dialekte (1882). Doch hatte er sich schon in seiner Jugend der Orientalistik zugewandt (Studi orientali e linguistici, 1855). In mehreren Publikationen beschäftigen ihn das Indische, das Türkische, das Hebräische, und dies neben fortdauernden, überwiegend phonetischen Studien zu den romanischen Sprachen, bei denen er die Reste des Keltischen aufdeckte — eine der frühesten Anwendungen der Substrattheorie —. Richtungweisend für seine komparatistische Methode war die deutsche Sprachwissenschaft, z. B. Franz Bopp, mit seinem Werke "Vergleichende Grammatik . . ." (1833 bis 1852).

1861 erhielt Ascoli den Lehrstuhl für vergleichende Grammatik und orientalische Sprachen an der Mailänder Akademie. Es war der erste komparatistisch-linguistische Lehrstuhl in Italien. 1870 erschien seine "Vergleichende Phonologie des Sanskrits, des Griechischen und des Lateinischen". 1873 gab er den ersten Band des "Archivio glottologico italiano" heraus, eine Serie, die er bis zum 15. Band redigierte.