Müller studierte in Bonn und Berlin und wurde ordentlicher Professor in Bonn 1830 und in Berlin 1833, wo er Physiologie und Anatomie lehrte.

Er war der bedeutendste Biologe seiner Zeit. Zu seinen Schülern zählten Schwann, Virchow, Helmholtz, Brücke und Du Bois Reymond, die später alle Mitglieder des Ordens wurden. Seine ersten größeren Arbeiten waren auf dem Gebiet der Sinnesphysiologie. Er formulierte das "Gesetz der spezifischen Energie der Sinnesorgane", nach dem jedes Sinnesorgan auf Reize immer nur mit der ihm spezifischen Weise reagiert, die Netzhaut zum Beispiel mit Lichtempfindung, auch wenn sie mechanisch, chemisch oder elektrisch gereizt wird. 

Seine zahlreichen Beiträge erstreckten sich auf viele andere Gebiete der Physiologie, vergleichenden Anatomie, allgemeinen Biologie und Naturphilosophie. Sein "Handbuch der Physiologie" (1833 bis 1840) hatte einen großen Einfluß auf die Entwicklung des Gebietes.